脑震荡

注册

 

发新话题 回复该主题

CCSChemistry南京大学江德臣团 [复制链接]

1#
中科白癜风恢复美丽*皮肤 http://pf.39.net/bdfyy/zqbdf/180415/6169119.html
<

近日,南京大学江德臣教授团队在纳米毛细管尖端建立了液态酶修饰的电化学传感器,实现了对单个活细胞中亚细胞区间的生物分析。包含有酶分子的液滴因纳米毛细管尖端的表面张力而被稳定地留存于针尖,可高效转化生物分子为电活性分子,完成固相修饰的纳米电极所难以实现的亚细胞水平生物分子实时定量分析。实验结果揭示了单个活细胞中神经鞘磷脂酶(SMase)在亚细胞水平分布异质性的特征。这一新型的液态酶修饰策略将为纳米电化学传感器设计提供了新思路,为电分析化学在单细胞研究中的发展提供了新方法。

背景介绍:

生物分子功能的异质性与其在亚细胞中的位置相关,其分子信息的提取能够为了解生物分子的生化机制提供重要线索。因此,在亚细胞水平上实时、定量分析单个活细胞中生物分子至关重要。经典纳米电化学传感器通常采用化学修饰或物理固定方法将识别/转化元件组装在纳米电极表面,形成固相传感层,继而对单细胞中生物分子进行定量分析。然而,这种固相修饰的策略存在有一定的局限性,包括:(1)能被修饰在电极表面的识别/转化分子数目和种类有限,限制了其能够分析的生物分子类型;(2)相对于溶液中的分子活性,固定在电极表面的识别/转化分子会损失部分活性而降低转化率和检测灵敏度,增加了在亚细胞水平进行高灵敏电化学检测的难度。为此,南京大学江德臣课题组一直在努力开发新型修饰策略,期待能够普适性地修饰多种识别/转化分子于纳米电极表面,最大程度地保持其活性以提高检测灵敏度,从而可在亚细胞水平上对低丰度生物分子加以实时定量检测。

图1.液态酶纳米电化学传感器实时定量分析亚细胞区间中生物分子。

本文亮点:

为了解决这一技术难题,南京大学江德臣教授课题组将包含有多种试剂盒组分的纳米液滴装载于镀铂的空心碳纳米毛细管尖端。纳米毛细管尖端开口狭窄,对液体具有很高的表面张力,因此可稳定储存纳米液滴于尖端;装载过程无需任何化学修饰步骤,可普适性修饰多种试剂盒组分;试剂盒组分溶解在溶剂中,保持了高反应性,可最大限度地提高反应的转化率。此外,由于针尖飞升体积的限域效应,试剂盒组分中的酶活性将显著高于其在本体溶液中的活性,可更高效率的转化目标检测分子为电活性分子。因此,基于液态酶修饰的纳米电化学传感器具备高灵敏度和时空分辨能力,可普适性地对单个活细胞中亚细胞区域内少量生物分子进行实时定量分析(图1)。

图2.液态酶纳米电化学传感器制备过程。

制备液态酶纳米电化学传感器包含三个步骤。首先,使用激光拉针仪拉出尖端孔口直径约为70nm的空心纳米毛细管,利用化学气相沉积技术在毛细管内壁沉积碳层(5-10nm)。随后,在针尖内壁碳层上电化学沉积铂颗粒。最后,将包含有试剂盒组分的液滴通过负压抽取的方式加载到电极尖端,制备成液态酶修饰的纳米电化学传感器(图2)。

图3.液态酶纳米电化学传感器检测(a,b)葡萄糖和(c,d)神经鞘磷脂酶(SMase)。

该研究以葡萄糖和神经鞘磷脂酶(SMase)两种重要生物分子为模型,对液态酶纳米电化学传感器性能进行了评估。随着待测分子浓度升高,电流响应逐渐变大;连续观察30min内响应,发现电流响应信号具有良好的稳定性(图3)。这些结果证明纳米电化学传感器尖端液滴中的试剂盒组分可以作为稳定传感层。更重要的是,液态酶纳米电化学传感器检测灵敏度显著高于固相修饰的纳米电极,体现出该种修饰方法在低丰度分子检测中的优越性。

图4.液态酶纳米电化学传感器分析单个MCF-10A细胞中葡萄糖浓度。

随后,将构建的液态酶纳米电化学传感器插入单个活细胞中,进行葡萄糖分析。扎入后观测到约2pA的稳定电流增加,并在电极撤出细胞后电流迅速降至初始值(图4a和b)。对25个细胞分别进行分析,电流增加值的相对标准偏差为99.3%(图4c),表明单细胞内葡萄糖浓度具有高度异质性。为了研究针尖液滴中酶分子在细胞内的扩散程度,我们在液滴中加入荧光素;在扎入细胞5min后,仅在胞内观察到约0.5μm的荧光点(图4d),表明液滴的分子能够稳定地留存于纳米电极尖端,实现高灵敏单细胞分析。

在此基础上,利用液态酶纳米电化学传感器对单个CT26细胞中SMase的活性进行分析,获得了类似的结果。电流响应时间小于2s,与固相修饰纳米电极性能相当,进一步证明该传感策略能够在单细胞水平对电化学难检分子(SMase)的活性进行原位、实时和定量分析(图5a和b)。

图5.液态酶纳米电化学传感器用于单个CT26细胞内SMase活性的高空间分辨分析。

最后,使用液态酶纳米电化学传感器对单个活细胞中五个不同亚细胞区域中SMase的活性进行定量分析(图5c)。在不同区域处,观察到不同的电流响应,揭示了活细胞内SMase活性具有明显的空间异质性(图5d)。值得

分享 转发
TOP
发新话题 回复该主题